En teoría si la sala es suficientemente pequeña como para que su resonancia baja esté por encima del corte del sub, cualquier frecuencia que emita este por efecto de la sala estará siempre en sobrepresión, por lo que su posición no es crítica respecto a la respuesta de sala. Si es mayor la sala de modo que su resonancia baja está en el rango que reproduce el sub, le afectará su posición al actuar la huella acústica de la sala, por lo que la posición del sub será importante; en teoría donde menos excite las estacionarias de la sala y por tanto alterar la respuesta lineal del sub.

Y en cualquier caso, siempre se calibra con todos los subs que vayas a utilizar conectados, ya que dependerá la posición de cada uno (si es el segundo caso detallado antes más aun, pues como he indicado variará la sobrepresión a según qué frecuencias, estacionarias, y eso ha de compensarlo la calibración) para la fase acústica en el punto de medición/escucha, el retardo a aplicar en cada uno de ellos para compensar esa fase acústica, la presión sonora en cada uno de ellos y la suma de todos.

Si calibras con dos de ellos, y luego añades otros dos, dependerá de cada caso lo que puedas notar o no en la respuesta, pero sin duda variarás la fase acústica, la presión sonora total y el equilibrio respecto al resto de canales, la respuesta en frecuencia de la sala.

Otra cosa es cuánto te preocupa, o lo notas en la respuesta sonora, o te lo puedes permitir (en caso de salas no dedicadas). Como casi todo en esta afición, es relativo ;-)

Saludos.